A introdução e o uso de fungicidas sítio-específicos (monossítio) há 60 anos revolucionaram o controle químico de doenças de plantas. Estes compostos químicos mostraram-se altamente eficientes, com pequeno impacto negativo ao ambiente, baixa fitotoxicidade e eficiência com dose baixa. No entanto, na década de 1970, foi verificado que os fungos fitopatogênicos podiam adaptar-se, através de mutações, levando à resistência e à redução de sua eficácia.

Como consequência de seu uso sem a adição de multissítio, frequente e repetido, a resistência tornou-se um problema cada vez mais frequente.
Serve de exemplo a evolução da redução do controle da ferrugem asiática da soja ocorrendo desde a safra 2008 (Silva et al., 2008).

A maioria dos fungicidas monossítios são penetrantes-móveis (impropriamente chamados de sistêmicos) e aplicados nos órgãos aéreos podem ser absorvidos pelas folhas com distribuição parcial no limbo seguindo o fluxo do xilema (movimento apical).
Os compostos monossítios que dominam o mercado são os inibidores da desmetilação (IDMs), inibidores da quinona externa (IQes), inibidores da succinato desidrogenase (ISDHs) e os inibidores da síntese da tubulina (IST).

A resistência ao sítio-alvo tem sido observada para todos os fungicidas monossítios frequentemente envolvendo resistência cruzada e múltipla (Kitchen et al., 2016). O desenvolvimento da resistência é uma forma de evolução dos seres vivos e ocorre sob dois mecanismos:
a) Variabilidade genética: esporos do fungo com genes necessários para resistir à substância tóxica;
b) Seleção: os fungicidas não são agentes mutagênico apenas selecionador devido a seu uso repetido.

A redução da sensibilidade a fungicidas envolve uma propriedade fundamental dos fungos, a habilidade de adaptação a diferentes condições de ambiente, normalmente adversas e, assim, de sobreviver. O uso frequente de fungicidas cria um ambiente adverso para um fungo que antes era sensível a um determinado composto, levando à sua adaptação e à resistência à nova situação.

Conceito de resistência

É uma alteração herdável e estável em um fungo em resposta a aplicação de um fungicida penetrante-móvel monossítio resultando na redução da sensibilidade ao produto. O termo é empregado para designar populações de fungos anteriormente sensíveis que por meio de mutações, reduziram significativamente a sensibilidade ao fungicida (European, 1988).

Os fungicidas penetrantes-móveis, monossítios, têm apresentado vida efetiva curta, isto é, o número de safras consecutivas em que o tratamento com fungicida manteve controle econômico da doença (Hollomon, 2015).

Detecção da redução da sensibilidade de fungos a fungicida

A resistência é um problema reconhecido pela redução no desempenho do fungicida, ao longo de várias safras, ao qual os produtores tentam recuperar o controle pelo aumento da dose ou reduzindo a frequência das pulverizações.

a. A primeira observação da ocorrência da redução da sensibilidade de um fungo patogênico a fungicida ocorre em lavouras levando o produtor a reclamar da falha de controle; o primeiro a observar a falha em sua lavoura;

b. Logo a seguir, experimentos conduzidos no campo comparando o controle atual do fungicida suspeito com dados do seu desempenho nas safras anteriores permite constatar a alteração (redução da sensibilidade do fungo) (Reis et al., 2020);

c. A confirmação da alteração é feita em testes em casa-de-vegetação ou em laboratório determinando a sensibilidade do fungo pela concentração inibitória (CI50), em plântulas, em folhas destacadas, em discos foliares, na geminação de esporos e no crescimento do micélio in vitro (Blum e Reis, 2013).

d. Finalmente pode ser feita, por técnicas moleculares, a identificação da mutação envolvida por instituições qualificadas para essa tarefa (Duan et al.,2019; Ishii & Hollomon, 2015; Mathew et al., 2019; Reis et al., 2017; Simões et al., 2018Schmitz et al., 2014; Stamler et al., 2009). Conforme relato de Hollomon (2015), a identificação da mutação é útil somente após a resistência ter sido confirmada em bioensaios.

Conceito de mutação

Mutação é qualquer alteração no material genético de um organismo. Essa alteração pode ocasionar uma mudança correspondente no fenótipo do indivíduo. As mutações podem ocorrer de forma espontânea ou de forma induzida. De forma espontânea, ocorre devido a erros na replicação do DNA. Mutante é o fungo portador de mutação. A ocorrência das mutações em P. pachyrhizi aos fungicidas sítio-específicos resulta na redução da sensibilidade do fungo, redução da eficácia do controle, redução na produtividade pelo aumento do dano e menor lucro o produtor. Portanto, a ocorrência de mutações no fungo, conferindo resistência ao fungicida alvo do controle é indesejável.

Até a data desta publicação já foram identificadas oito mutações em P. pachyrhizi conferindo redução da sua sensibilidade aos IDMs, IQes e ISDHs, todos sítio-específicos e nenhuma aos multissítios.

Por exemplo, sabendo-se da ocorrência da mutação F120L, que confere redução da sensibilidade de P. pachyrhizi aos fungicidas IDMs, qual a medida de controle recomendável para o fungo, com essa mutação, para  evitar danos à soja. Ainda mais, para cada uma das oito mutações tem-se uma medida contra cada uma especificamente ou apenas uma medida é eficiente as oito mutações? Há estratégia (s) para anular ou eliminar o efeito ou reverter a mutação?

Ênfase tem sido dada à divulgação das mutações ocorrentes em P. pachyrhizi, levando os ouvintes/leitores a se convencerem de que as conhecendo serão empregadas medidas de controle diretamente e especificamente a elas para o manejo da resistência. Nesse sentido, nos principais encontros científicos têm sido feitas apresentações do mais profundo conhecimento de bioquímica e de técnicas moleculares na identificação das mutações em P. pachyrhizi. Porém, pouco tem sido apresentado sobre as estratégias de manejo da resistência, com base científica, de P. pachyrhizi aos fungicidas monossitios, pelos especialistas em mutações.

Exemplos de mutações identificadas em fungos patogênicos à soja. Até a presente data, as seguintes mutações foram identificadas em fungos patogênicos à soja:
1. Em Phakopsora pachyrhizi:
IQes: F129 L (Klosowski et al., 2015)
IDM:  F120L, Y131F/H, K142R, I145F, I475T (Schmitz et al., 2014)
ISDH: C-I86F (Simões et al., 2014) e C-N88S (Corteva/FRAC, informação verbal)

2. Em Corynespora cassiicola:
IST: mutações G134A, F134L, G137R (Duan et al., 2019)

3. Em Cercospora sojina:
IQe: mutação G134A (Mathew et al., 2019).

4. Em Cercospora kikuchii:
IQe: mutação G134A (Sautua et al., 2019).

Visando o melhor entendimento do leitor são apresentados dois casos:

Exemplo 1. Um produtor na safra 2005/06 reclamou da falha de controle da ferrugem da soja pelo uso de fungicida inibidor da desmetilação (IDM, ciproconazol, epoxiconazol, flutriafol, tebuconazol) aplicado isoladamente (Silva et al., 2008). Ele argumentou que em safras anteriores o controle obtido com o mesmo fungicida foi > 80% (considerado eficiente economicamente).
Na busca da resposta ao problema, em experimentos realizados no campo foi comprovada estatisticamente a redução do controle (Reis et al., 2017; Reis et al., 2020).

Concomitantemente, em experimento em laboratório com folíolos de soja destacados, a concentração da referência da sensibilidade máxima de Phakopsora pachyrhizi Syd. & Syd. A um IDM a CI50 = 0,07 mg/L, para uma amostra da população do fungo coletada, mantida e armazenada desde a safra 2007 (Blum & Reis, 2013) apresentando sensibilidade máxima ao fungicida.

Agora, com amostra da população do fungo da safra 2011/12, com o isolado suspeito da lavoura do produtor reclamante, a CI50 foi de 1,8 mg/L, com um fator de redução da sensibilidade (FRS) de 25 (FRS = 1,8/0,07 = 25) confirmando a redução da sensibilidade do isolado suspeito. De posse dessas informações o consultor explica ao produtor a causa da falha de controle ocorrida em sua lavoura: uso repetido de fungicida sítio-específico, numa grande área e com várias aplicações por área.

A redução da sensibilidade de 0,07 mg/L (2007) para 1,8 m/L (safra 2011/12), explica a presença da resistência (FSR >1,0) do fungo ao fungicida aplicado na lavoura do produtor. Diante do fato, como medida correta, o consultor lhe recomenda parar de usar qualquer IDM isolado devido à resistência cruzada (Xavier et al., 2015), mas sim sempre e em toda a área usar monossítio (IDM, IQe, ISH) em mistura com multissítio (clorotalonil, ou mancozebe, ou oxicloreto de cobre).  Essa é a estratégia mais eficiente para reduzir o impacto negativo da resistência (Reis et al., 2015; Ishii & Hollomon, 2015).

Ao mesmo tempo, uma amostra da população do fungo, com CI50 de 1,8 da lavoura do produtor, foi encaminhada a um laboratório de análise molecular e identificada a mutação F120L, como responsável pela redução da sensibilidade de P. pachyrhizi ao IDM (Schmitz et al., 2014).
Sabendo agora que na lavoura onde houve a falha de controle, foi identificada a mutação F120L (Schmitz et al., 2014) muda a recomendação inicial do consultor de não usar mais IDMs isolados, ou em suas misturas duplas, ou há uma estratégia distinta, específica à mutação F120L?  Qual a informação mais importante para a tomada de decisão do consultor: a alteração da CI50 de 0,07 para 1,8 mg/L (FRS = 25), ou a identificação da mutação F120L?

Considerando a ocorrência de oito mutações distintas à P. pachyrhizi conferindo resistência cruzada e múltipla aos IQes, IDMs e ISDHs, a estratégia anti-resistência contempla separadamente as oito variantes, ou continua a única eficiente do uso de fungicidas multissítio (clorotalonil, mancozebe ou oxicloreto de cobre) independentemente da(s) mutação(ões)?

A mistura de sítio-específico + multissítio é a tática que mais reduz a seleção direcional (Reis et al., 2017; Reis et al., 2020). Os multissítios não tem selecionado mutantes de P. pachyrhizi com redução da sensibilidade, pois não agem num sítio-alvo, mas sim em vários. Não se encontrou na literatura consultada redução da sensibilidade de P. pachyrhizi aos multissítios (clorotalonil, mancozebe e ou oxicloreto de cobre).
No caso da resistência cruzada e múltipla aos IDMs, IQes e ISDHs ocorrente para P. pachyrhizi, a estratégia anti-resistência mais eficiente hoje disponível, não é específica às mutações. Se nos três casos envolve oito mutações não são usadas oito estratégias, mas apenas uma, independentemente da mutação.

Misturas duplas ou triplas dos monossítios citados (IDM, IQe, ISDH), em mistura com um multissítio aplicados em toda a área cultivada com soja e em todas as aplicações pode ser a principal estratégia anti-resistência, independente das oito mutações ocorrentes.
Os fungicidas multissítios tem sido uma ferramenta única e insubstituível na luta contra a resistência de fungos a fungicidas (Ishii & Hollomon, 2015).

Exemplo 2. Em outra situação com a ferrugem da folha do trigo, causada por Puccinia triticina Eriks, na safra 2006, após 16 anos de uso do tebuconazol, 14 do ciproconazol e sete anos do epoxiconazol, surgiram as primeiras reclamações dos produtores da falha de controle da doença. Em trabalho conduzido nos anos de 2007/08, ‘in vivo’, foi comprovada a redução da sensibilidade de raças fisiológicas dominantes do fungo aos fungicidas IDMs com FRS de 9,3 a 110,66 para o tebuconazol (Arduim et al., 2012).

Não confunda raça com mutação ou mutante. O termo raça fisiológica descreve os indivíduos da mesma espécie, morfologicamente semelhantes e com mesma virulência. Patógenos de distintas raças fisiológicas apresentam diferentes níveis de virulência. No mesmo trabalho foi comprovado que as raças testadas se mostraram sensíveis aos IQes. Embora sem ter sido identificada a mutação do fungo naquele momento, o manejo recomendado da resistência, e seguido até hoje, consiste em não se usar IDMs isolados, mas sim em misturas com IQes em toda a área cultivada com trigo e em todas as aplicações (1).

Caso seja identificada a mutação, nada mudará na estratégia anti-resistência. Em 2009, foi identificada a mutação no codon 134 (Y134F) conferindo a redução da sensibilidade de P. triticina aos IDMs (Stamler et al., 2009), mas nada mudou em relação a estratégia anti-resistência, i.é, uso de fungicidas multissítios. Antes de ter sido identificada a mutação e, após, a estratégia tem sido a mesma.

Como exemplificado na Figura 1, em experimento conduzido no campo na safra 2014/15, momento em que ainda não tinham sido relatadas as mutações e devido ao desenvolvimento da resistência o controle da ferrugem pela adição de doses do multissítio mancozebe às misturas duplas ou triplas dos sítio-específicos, houve uma resposta positiva na melhora do controle para alguns sítio-específicos que apresentavam redução do controle pela presença da resistência.

Portanto, hoje sendo conhecidas oito mutações em P. pachyrhizi, a estratégia anti-resistência continua a mesma mesmo antes de sua constatação! A ação do multissítio mancozebe não visa à mutação, mas agindo em várias enzimas contendo tióis envolvidas na ruptura de moléculas de reserva na respiração celular (Hahm et al., 2015).

Em relação a redução dos danos causados pela ferrugem, o máximo rendimento foi obtido com controle > 80% (Reis et al., 2020). Porém o lucro máximo é função da eficácia do fungicida e do custo de sua aplicação.
A eficácia do controle da ferrugem nas colunas correspondentes ao fungicidas sem adição de multissítio variou de 21 a 71%. Controle superior a 80% foi obtido apenas com a maior dose do multissítio. Por outro lado, para alguns fungicidas mesmo na dose mais alta do multissítio, não foi atingido controle de 80% requerido para o máximo rendimento.

A identificação das mutações envolvidas é um complemento para explicar no mais alto nível do conhecimento científico o que está ocorrendo geneticamente no fungo, porém, sem aplicação prática. Para o consultor foi suficiente a informação de que o fungo teve a sensibilidade reduzida comprovada por experimentos no campo e pelo FRS.

A ênfase do tema pode ser dosada de acordo com os interessados no assunto. Para os diretamente envolvidos com o sistema produtivo como extensionistas, difusores da tecnologia, consultores e produtores deve focar na ferramenta eficiente no manejo da resistência ocorrente envolvendo os fungicidas sítio-específicos.

Como citado por Ishii e Hollomon (2015), a identificação das mutações é um conhecimento que ainda não pode ser usado pelos produtores e comprovado nos exemplos relatados.