Biodegradação de herbicidas e biorremediação: microrganismos degradadores de atrazina provenientes de solos da Região do Aquífero Guarani

Ueta, J*; N.L*; Shuhama, I,K*; Cerdeira, A.L#

*Departamento de Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto - USP; #CNPMA/EMBRAPA - Jaguariúna, SP - E-mail: Jueta@usp.br

Introdução

A agricultura moderna caracteriza-se por processos de mecanização e do emprego de agroquímicos em geral. Pesticidas tem sido de grande valia no aumento da produtividade de plantações protegendo-as contra injúrias e danos causados por organismos e plantas daninhas. Pesticidas são substâncias químicas desenhadas para matar organismos vivos e a EPA – agência de proteção ambiental americana – proíbe declarações que estes compostos são seguros ou não tóxicos. O mercado mundial de pesticidas atinge atualmente a elevada cifra de mais de 22 bilhões de dólares anuais. Sem o emprego destes pesticidas calcula-se que haveria uma queda na produção de cerca de 40%. Mais do que 40% destes compostos são representados por herbicidas, principalmente os triazínicos. No Brasil, o uso de pesticidas teve um aumento considerável a partir da década de 70, quando o país adotou o pacote agrícola intitulado ”Revolução Verde”, como forma de buscar o aumento imediato de produtividade. Em 1991 o consumo de pesticidas correspondeu a 3,7% do consumo mundial, que corresponde ao quinto lugar no cenário global (Spadotto et al, 1996). Acredita-se que somente cerca de 0,1% atinge o alvo específico enquanto os 99,9% restantes da aplicação tem potencial para se mover em diferentes compartimentos ambientais como as diferentes frações do solo, águas residuais e subterrâneas. Até fins de 1970 acreditava-se que a água subterrânea estava protegida de contaminação por pesticida pela superposição de camadas de solo da superfície, da sub-superfície, rochas e argila. Com a proliferação de métodos analíticos acurados e sensíveis percebeu-se que isto não era verdade. Rotineiramente equipamentos e metodologias sofisticados tem detectado quantidades tão pequenas como 1 parte por bilhão (ppb). Desde a última década vários estudos vem demonstrando continuamente a presença de herbicidas na água e nos alimentos, de forma que, atualmente, a maioria dos países industrializados dispõem de padrões de qualidade, a fim de assegurar a saúde e qualidade de vida da população (Hankin & Pylpiw, 1991; Williams et al, 1988).

A água

A água subterrânea vem atualmente despertando o interesse da humanidade, principalmente por se tratar de um recurso vital não renovável, a não ser por processos que exigem altos investimentos para torná-la novamente aproveitável e pelos riscos de contaminação. A preocupação com a água subterrânea é constante particularmente na Europa, uma vez que, praticamente, todos os manaciais, já apresentam problemas relacionados com a qualidade, especialmente a potabilidade da água. Como o custo de exploração da água subterrânea é bem menor do que o da água captada de rios, o uso daquela tem se intensificado bastante nos últimos anos . Na América Latina, em pelo menos três centros urbanos, Cidade do México, Lima e Havana, as águas subterrâneas participam da maior parte do suprimento municipal. Estima-se que 51% do suprimento de água potável no Brasil seja originário do recurso hídrico subterrâneo, proveniente de cerca de 200.000 poços tubulares profundos e milhões de poços escavados. Sessenta e um porcento dos núcleos urbanos do Estado de São Paulo são abastecidos total ou parcialmente por águas subterrâneas (Foster et al, 1993). Em virtude do inestimável valor das águas subterrâneas, pensar-se-ia que a proteção aos mananciais subterrâneos fosse uma prioridade para os administradores públicos. Isto, infelizmente, ainda não é verdade. Talvez seja pelo fato que esse bem, para sua captação, não exige obras de cunho eleitoral, contrariamente do que oferece a captação das águas superficiais (Rocha, 1996). Por outro lado, dentro de uma abordagem mais específica, tem sido constatado que o fluxo dos aqüíferos e o transporte de contaminantes não são fáceis de serem observados e medidos. Ambos são geralmente lentos. Por estas razões e em grande parte pela ausência de pesquisas no Brasil, os riscos de contaminação de mananciais subterrâneos têm aumentado consideravelmente, principalmente por fontes pontuais, relacionadas às atividades urbanas e industriais. Nos Estados Unidos, a contaminação da água subterrânea por fertilizantes químicos e pesticidas tem sido documentada por várias agências públicas. Em vários poços artesianos e semiartesianos dos Estados Unidos foram observados valores elevados de concentração de alachlor, atrazina, DBCP, EDB e lindane (Flury, 1996). A ocorrência de pesticidas na água subterrânea tem mostrado que há necessidade premente de estudos sobre o entendimento dos processos de transporte desses compostos nos solos, incluindo os horizonte subjacentes até a zona saturada (Lara & Barreto, 1972; Yen et al, 1994; Peixoto et al, 2000).). Tais estudos devem necessariamente enfocar os processos de lixiviação e de escoamento superficial ou ”runoff”. Em essência, esses processos são interdependentes. Estudos também devem ser realizados no sentido de se compreender os mecanismos de degradação que contribuem para o desaparecimento destes xenobióticos

A Atrazina

Atrazina, um herbicida triazínico, é o mais empregado mundialmente, seja nos Estados Unidos ou Brasil. Nos anos 50 a Geigy, na Suíça, descobriu as propriedades herbicídicas das s-triazinas entre elas a atrazina, simazina, propazina, ametrina e cianazina. A atrazina foi patenteada na Suiça em 1958 e registrada para uso comercial nos Estados Unidos em 1959. É um herbicida seletivo para o controle de plantas de folha larga e gramíneas agindo como um inibidor de fotossíntese. No Brasil é registrada para uso em culturas de milho, sorgo, cana de açúcar, banana, café, etc., sendo embalado por diferentes empresas a concentrações de 500g/L. A Novartis é o produtor principal de atrazina e simazina, enquanto a DuPont manufatura cianazina. Em 1995 a DuPont anunciou a retirada voluntária de cianazina concordando com a EPA em reduzir o índice de uso de cianazina durante 97 e 98 e interromper a produção em 99, extinguindo-se os estoques em 2002, em decorrência de riscos potenciais ao ambiente. Após a aplicação, a atrazina pode-se tornar um contaminante potencial de aqüíferos baseado em suas características físico-químicas. Ela apresenta alta persistência no solo, sendo comumente detectado após um ano, hidrólise lenta, absorção moderada à matéria orgânica e argila, baixa pressão de vapor, alto potencial de escoamento, solubilidade de baixa para moderada em água. O monitoramento de poços norte-americanos mostrou que 4% dos 15000 poços estavam contaminados com atrazina e em algumas regiões mostravam elevados índices de contaminação. No caso das águas superficiais não é diferente. Por exemplo, tem sido estimado que o Rio Mississipi carreia anualmente, cerca de 160 toneladas de atrazina, 71 toneladas de simazina, 56 toneladas de metolachlor e 18 toneladas de alachor para o Golfo do México (Pereira & Hostettler, 1993). Inúmeros outros trabalhos científicos têm relatado a presença de agroquímicos e seus produtos de degradação em águas superficiais e subterrâneas em concentrações capazes de causar danos ao meio ambiente e saúde do Homem (Wauchope, 1978; Zhang et al, 1997). Atrazina, contaminante mais freqüente foi encontrado em águas subterrâneas dos Estados Unidos, Austrália e Canadá (Parsons & Witt, 1989; Hallberg, 1989, Preece & Whalley, 1993 em Zwieten & Kennedy,1995). No Canadá os índices relatados por Belluck et al, 1991 alcançaram 10µg/L, enquanto na Austrália foram encontrados em água de rio concentrações tão altas como 15,9 µg/L. Como qualquer medicamento para uso humano ou veterinário o emprego de pesticidas é uma questão de dose e de uso correto e efetivo. Simples analgésicos para combater a dor podem até matar dependendo da dose, do tipo, das contra-indicações e uso irracional. Como os medicamentos para a saúde do homem, os químicos agrícolas, como os fertilizantes e pesticidas, são considerados indispensáveis na agricultura moderna. No entanto, em função da intensidade de uso, as aplicações tem se dado, muitas vezes, de forma inadequada. Esse uso incorreto, particularmente aquele em que há excesso do produto causa sérios problemas ambientais em vários agro-ecossistemas. Deve-se levar ainda em consideração que todas as propriedades físicas e químicas individuais do solo e da água e os organismos vivos presentes nestes compartimentos ambientais afetam o destino e o comportamento da atrazina bem como de outros pesticidas, além do clima e topografia. Apesar da presença confirmada de atrazina em manancias de água, alguns defensores dos herbicidas triazínicos defendem que estes vem sendo empregados de forma segura e a restrição e uso poderia comprometer economicamente a agricultura (Triazine Network). A maior parte da contaminação pode ser conseqüência do escoamento superficial (run-off) em áreas de cultivo. Segundo Bode (1990) em termos de exposição do homem à contaminação de águas subterrâneas e de solo por ”derramamento” acidental, como os de petróleo e negligência no trato pode ser mais significante do que o transporte superficial. Toneladas de atrazina são estocadas nos locais de preparo e embalagem em condições muito distantes das ideais. A falta de cuidado pode ser responsável por situações de contaminação elevada. Uma pequena quantidade de atrazina pode contaminar um grande aquífero. Dez quilos de atrazina dispersado uniformemente através de um aqüífero é suficiente para contaminar 10 milhões de litros de água a um nível de 100 ppb, muito além da concentração máxima limite de 3 ppb. Através do processo de acumulação pesticidas podem acumular em organismos inferiores sendo passados a organismos superiores na cadeia alimentar quando são ingeridos. Os mais superiores acumularão a níveis mais altos. Os níveis em peixes por exemplo podem ser dezenas a centenas de vezes maiores que no ambiente aquático em que eles vivem. Os humanos estão no topo da cadeia alimentar. Eles bioacumulam os pesticidas acumulados pelos animais e plantas que fazem parte de sua dieta alimentar.

Os microrganismos e a biodegradação de atrazina D

O solo é habitado por um conjunto de microrganismos que interagem com outros seres vivos e a diversidade e densidade destes microrganismos depende das condições ambientais. Assim solos diferentes podem ter populações distinguíveis uma da outra. Qualquer mudança no ambiente fornecerá condição para modificar a população microbiana. O manejo do solo e o uso de agroquímicos para melhorar os rendimentos da colheita promovem modificações diversas na microbiota através de seus efeitos sobre os diversos fatores do solo e planta, que podem favorecer ou diminuir a proliferação de espécies e o florescimento de outras, levando a comunidade a um novo equilíbrio microbiano favorável, inócuo ou desfavorável ao ambiente (Gaur & Misra, 1978; Percich & Lockwood, 1978; Hicks et al, 1990, de Cal et al, 1993). Em sua maioria compostos xenobióticos empregados na agricultura não se perpetuam no ambiente em virtude dos processos de degradação, transformação ou metabolismo de pesticidas geralmente microbiana, que ocorre principalmente no solo reduzindo o esqueleto orgânico a CO2 e outros metabólitos inócuos ao ambiente (Kobayashi & Rittmann, 1982). O uso intensivo de agroquímicos pode, no entanto, sobrecarregar a capacidade metabólica dos microrganismos, permitindo que resíduos tóxicos se movimentem pelo solo atingindo as águas subterrâneas. A contaminação química de lençóis de água subterrânea representa uma grande ameaça à saúde humana. Os estudos da relação microrganismos-pesticidas tem enfocado principalmente aspectos relacionados à degradação destes compostos pelos microrganismos, no sentido de compreender os mecanismos para se evitar o bioacúmulo deles no solo, na água ou na cadeia alimentar, bem como os efeitos destes produtos sobre a atividade microbiana e processos físicos, químicos e bioquímicos que ocorrem no solo. A permanência destes compostos ou a mineralização podem ser calculados através de estudos de meia-vida e ensaios de mineralização. Características do solo, do composto e do ambiente podem comprometer severamente a biodegradação. Os dados para atrazina de meia-vida e mineralização referentes a persistência no solo descritos na literatura evidenciam uma variação acentuada. Estas variações podem ser conseqüência das características ambientais do local em estudo. Meia-vida para solos tão curta quanto de 30 dias (Solomon et al, 1996) e longa como 166 semanas (Bowmer, 1991) foram descritas. A mineralização ou seja a transformação de atrazina em CO2 , Cl e NH3 é um processo mais longo. A degradação microbiana muitas vezes não conduz à mineralização total da atrazina, ou seja até transformação a CO2 e NH3, totalmente inócuos. Pode ocorrer a degradação parcial a compostos ainda considerados fitotóxicos. Algumas espécies microbianas isoladas de solo são capazes de pelo menos parcialmente metabolizar atrazina: Pseudomonas, Nocardia, Rhodococcus , NI86/21, TE1 e B-30, Aspergillus fumigatus e Rhizopus stolonifer, (Bekhi et al, 1993; Bekhi & Khan, 1986); enquanto consórcios microbianos ou culturas mistas com 2 ou mais microrganismos podem levar à mineralização (Levanon, 1993). Culturas puras capazes de mineralizar atrazina foram encontradas somente a partir de 1995 tendo sido identificadas como Pseudomonas e Agrobacterium radiobacter (Yantze Kontchou & Gschwind, 1994; Mandelbaum et al, 1995; Radosevich et al, 1995; Struthers et al, 1998)

A biorremediação

Quando ocorre um derramamento acidental ou por negligência de grandes quantidades de substâncias como petróleo que comprometem o ambiente, seja solo ou água, medidas remediadoras para se evitar um grave acidente devem ser tomadas. Os processos de remediação do local contaminado podem variar desde a preparação de um aterro sanitário, queima de solo, recolhimento do contaminante para posterior tratamento que resultam em descontaminação quando as medidas são executadas com sucesso. Pode-se também utilizar processos de biorremediação. A biorremediação emprega processos que utilizam sistemas de tratamento biológico para reduzir ou destruir resíduos nocivos ao ambiente (Ueta et al, 1999). O recente derramamento de óleo no rio Iguaçú, PR, foi parcialmente sanado por biorremediação, sendo esta técnica empregada com sucesso em vários acidentes petrolíferos, amplamente noticiado no pioneiro caso da Exxon Valdéz. A biorremediação surgiu para explorar a diversidade genética e a versatilidade metabólica dos microrganismos em transformar os contaminantes em produtos menos lesivos que podem ser integrados ao ciclos biogeoquímicos naturais. A biorremediação pode ser alcançada pela adição de nutrientes que estimulam o crescimento de microrganismos nativos (bioestímulo) ou pela introdução de microrganismos selecionados ao local contaminado (bioaumento). Tanto um processo quanto outro tem encontrado dificuldades, principalmente pelo fato de que a compreensão científica da biorremediação está se iniciando. Microrganismos com capacidade metabólica de mineralizar contaminantes podem ser muitas vezes essenciais no processo de biorremediação, principalmente aqueles organismos mais raros, como os mineralizadores de atrazina que reduzem a atrazina a gás carbônico e amônio.

A Microbacia do Espraiado

Como grande consumidor de herbicidas empregados no cultivo da cana de açúcar, milho, sorgo, etc., o Brasil possui uma variedade de sistemas ecológicos, que necessitam ser devidamente protegidos do impacto da agricultura intensiva. Em um aqüífero de escala regional, a quantidade total de pesticidas usados e a intensidade de uso são fatores importantes, principalmente em relação às áreas de recarga. Muitos locais, como ribeirões e outros cursos d’água são abastecidos por água subterrânea, cujo controle de fluxo depende do gradiente hidráulico determinado pelo nível do ribeirão e elevação do nível da água subterrânea. A geologia define as características do sistema de água subterrânea. Estudos geológicos identificaram área de alto risco de contaminação de águas subterrâneas por agroquímicos, localizada na região de Ribeirão Preto. A área objeto de estudo situa-se entre as coordenadas 21º 05’ e 21º 20’de latitude sul e 47º 40’e 47º 50’de longitude W.Gr. A altitude média é de 600 m. O relevo dominante é do tipo suave ondulado. O solo é constituído dominantemente por Latossolo Roxo de caráter distrófico e eutrófico em proporções semelhantes. Na porção mais jusante da área predominam solo arenosos do tipo Latossolo Vermelho-Escuro textura média e Areia Quartzosa. A vegetação original era composta por mata tropical a subtropical subcaducifólia . A geologia é constituída por dois litotipos distintos: rochas basálticas da Formação Serra Geral à montante e arenitos da Formação Botucatu à jusante da área. Do ponto de vista climatológico, a área está inserida na classificação climática do tipo tropical de inverno seco de savana (AW) conforme Koppen. A temperatura média anual oscila entre 21° e 22 ºC. A precipitação anual varia de 1300 a 1500 mm. A evapotranspiração potencial obtida pelo método de Thorntwaite atinge 1000mm/ano. No caso da hidrogeologia regional, destaca-se o aqüífero Guarani (antigo Botucatu), com área de recarga de 16.000 Km2 no Estado de São Paulo. A área foi denominada microbacia do Espraiado. Caracteriza-se por atividade agrícola intensa, principalmente cultivo de cana e uso constante de herbicidas. O aqüífero Guarani, um dos reservatórios de águas subterrâneas do planeta, cobrindo 60% do Estado de São Paulo, mais vários estados brasileiros e países da costa oeste da América do Sul (figura 1) é responsável pelo abastecimento de água de porção considerável do Brasil, e a região de Ribeirão Preto é totalmente abastecida por esta água subterrânea.

Objetivos do trabalho

Nossos estudos microbianos estão voltados à caracterização da população microbiana de amostras de solo coletadas na microbacia do Espraiado e dos efeitos dos herbicidas atrazina e 2,4-D sobre os microrganismos, tentando-se isolar e identificar os resistentes aos herbicidas e potencialmente biodegradadores. Neste trabalho relatamos a capacidade dos microrganismos selecionados por atrazina e 2,4-D em suspensões de amostras de solo da microbacia em biodegradar atrazina. Os biodegradadores poderão ser empregados em processos de biorremediação para a descontaminação de sítios contaminados. Para este processo estaremos empregando tecnologia de microencapsulação para disponibilizar os microrganismos selecionados no ambiente de forma controlada otimizando a habilidade microbiana de descontaminação, sem riscos ao ambiente.

Procedimento Experimental

Amostras de solo de 9 pontos representativos dos diferentes tipos de solo escolhidos de acordo com a superposição de mapas geológicos de tipos de solo, condutividade hidráulica, inclinação, infiltração e potencial de lixiviação foram coletadas por 18 meses a profundidades de 0-20cm e 80-90cm para estudos microbiológicos (Rocha et al ,1997l; Ueta et al, 1999). Os solos geralmente ácidos apresentavam diferentes texturas e os empregados neste relato estão discriminados na Tabela 1 (Cerdeira et al, 1998).

Tabela 1. Textura das amostras de solo

Ponto

Areia

Areia Fina

Argila

Silte

Tipo de Solo

PO4 (0-20cm)

4,4

11,0

56,5

28,1

argiloso

PO4 (80-90cm)

2,3

8,3

67,3

22,1

argiloso

P06 (0-20cm)

4,4

14,3

58,7

22,5

argiloso

P20 (80-90cm)

14,3

31,33

45,1

9,5

textura fraca

P33(0-20cm)

41,6

42,9

10,8

4,7

areia fraca

P35 (0-20cm)

29,3

65,0

2,4

3,3

arenoso

P24 (0-20cm)

56,4

35,2

7,2

3,1

arenoso

Tabela 2. Biodegradação de atrazina por microrganismos de amostras de solo

Amostr

de solo

MM

MMA

certrimida

MMcet

MMAcet

biodeger

A

P06SAAt

-

+(76%)

+

-

+

B

P04SMAt

-

E

P04SMAt

-

+

-

F

P33SAD

+(100%)

-

+

I

P04SMD

+ (100%)

-

+

-

+

J

P20sMC

-

+

+(80%)

-

+

Tabela 3. Percentual de redução de atrazina em meio tripticase, após incubação das amostras por 26 dias

Amostra de solo

% redução

A

P06SAAt

50

B

P04sAAt

50

C

P35SAAt

82

D

P33SMAt

0

E

P04SMAt

54

F

P33SAD

57

G

P33SMD

50

H

P24SMD

23

I

P04SMD

68

J

P20sMC

53

Suspensões de solo foram incubados em meio contendo atrazina (1mg/mL, gentilmente cedido pela Novartis) ou 2,4-D (0,5mg/mL, Merck) ou diluente foram incubadas por 21 dias e analisadas microbiologicamente. Alíquotas das suspensões foram mantidas em freezer (-200 C) em glicerol 25%. Foram selecionadas 10 suspensões representando solos de diferentes texturas coletados em abril e maio de 97 para os estudos de biodegradação. As amostras foram codificadas com S para 0-20cm, s para 80-90cm, M para maio, A para abril, At para atrazina , D para 2,4-D, C (controle) e denominados A (P06SAAt), B (P04sAAt), C (P35SAAt), D (P33SMAt), E (P04SMAt), F (P33SAD), G (P33SMD), H (P24SMD), I (P04SMD). J (P20sMC), Estas suspensões apresentavam populações microbianas distintas. Alíquotas (100µL) de cada suspensão foram transferidas para tubos contendo 5 mL de meio tripticase sem e com atrazina (50 µg/mL) e incubados por 24 ou 48 hs a 300C. Das culturas em tripticase 20 µL foram inoculados em meio cetrimida (3mL) a 350C por 48 h. Para a determinação da biodegradação de atrazina foi empregado meio contendo MgSO4, NaCl, CaCl2 e KH2PO4 sem (MM) e com (NH4)2SO4 (MMA) acrescido de atrazina (10 µg/mL). Células lavadas por centrifugação foram inoculadas em MM ou MMA (5mL) com atrazina e incubados a 30° C por diferentes períodos. Após incubação, 0,5 mL da cultura foi centrifugado (6000rpm/10min) e o sobrenadante utilizado para determinação da atrazina. A 100 µL do sobrenadante foi adicionado 500 µL de água MilliQ e 3 mL de diclorometano grau HPLC, para extração da atrazina. Após agitação por 60 segundos a soluçào foi centrifugado a 2500rpm/5min em centrífuga clínica. Um mL da fase orgânica foi submetido a secagem e o resíduo ressuspenso em 1 mL da fase móvel. O sistema cromatográfico para a CLAE consistia de coluna RP-18 (250x4.6 mm), detector UV a 220 nm, fase móvel de metanol:água (70:30), fluxo de 1mL/min. A cada determinação foi construída uma curva padrão geralmente na faixa de 2,5 a 15 µg/mL de atrazina

Resultados e discussão

No primeiro experimento foram empregadas 6 suspensões de solo 3 delas tratadas com atrazina, 2 com 2,4-D e 1 de amostra sem incubação inicial com herbicidas (Tabela 2). A partir de suspensão congelada com glicerol iniciou-se a pré incubação em meio tripticase para estimular o crescimento microbiano. Após 24 h a 30°C a cultura apresentava intensa turbidez, resultado do crescimento das espécies presentes. Os microrganismos destas culturas foram avaliados quanto a capacidade de biodegradar atrazina em meio mínimo sem (MM) e com sulfato de amônia (MMA) como fonte de N. Amostras para determinação de atrazina foram coletadas após 26 dias de incubação e os resultados mostraram que em 2 (F e I) das 6 amostras a atrazina havia desaparecido totalmente do meio de incubação MM, sugerindo biodegradação. No entanto toda a atrazina permaneceu no meio MMA. Em uma amostra (A) 76% da atrazina desapareceu do meio MMA, mas permaneceu inalterada em MM. Em culturas provenientes das outras 3 amostras não houve nenhum consumo de atrazina seja em MM ou MMA. No segundo experimento 20 uL das 6 suspensões em tripticase (24h) foram transferidos para meio cetrimida líquido, um meio seletivo que permite o crescimento de Pseudomonas entre outras espécies. Os meios foram incubados a 350 C e após 48 h não se observou nenhum crescimento nas amostras B e F, indicando que todas as linhagens eram sensíveis a cetrimida. A incubação das amostras que mostraram crescimento em cetrimida foram analisadas para biodegradação após 19 dias em atrazina em meios MM e MMA. Somente a amostra J mostrou consumo de 80% da atrazina presente no meio MM. Os resultados do primeiro e segundo experimentos estão sumarizados na Tabela 2 e mostram que de 6 amostras 4 foram capazes de biodegradar atrazina. Tentativas de aprimoramento dos índices de biodegradação em MM e MMA com suspensões celulares provenientes de meio tripticase de 48 h, transferidas ou não para meio cetrimida, com períodos de incubação de 7 a 30 dias não resultaram em redução nos teores de atrazina dos meios. Novo experimento foi realizado empregando-se 10 amostras de suspensões de solo (ver procedimento experimental) em meio tripticase com 50 µg/mL de atrazina seguido de todo o procedimento realizado anteriormente. Em nenhuma das condições ocorreu o desaparecimento de atrazina dos meios MM e MMA. No entanto, a avaliação da concentração de atrazina no meio tripticase mostrou o desaparecimento de até 80% de 50µg/mL de atrazina presente nas amostras, conforme mostrado na Tabela 3. Os experimentos prosseguem procurando-se definir o processo de biodegradação e as espécies em cultura pura ou consórcios microbianos capazes de metabolizar ou mineralizar atrazina. Os resultados de biodegradação obtidos com 10 suspensões de amostras de solo tratadas com atrazina ou 2,4-D ou sem tratamento mostram a presença de linhagens microbianas biodegradadoras. As amostras de solo provenientes de região de cultivo de cana-de-açúcar tem histórico de utilização intensiva de agroquímicos incluindo os herbicidas atrazina, simazina, ametrina, tebutiuron, diuron, 2,4-D e picloram (Cerdeira et al, 1998). Existe a preocupação de que o uso intensivo destes agentes possa ser fonte de contaminação do aquífero Botucatú na área de recarga. Pelos dados apresentados pode-se concluir que a presença inicial de atrazina na suspensão de solo não foi fator determinante na seleção de linhagens metabolizadoras. O fato das amostras tratadas com 2,4-D ou sem tratamento conterem populações capazes de agir sobre atrazina pode ser explicado pelo histórico do local onde as amostras foram coletadas. Nas condições do ensaio não se evidenciou o desaparecimento da atrazina em todas as amostras mantidas em atrazina, o que não significa ausência de tais microrganismos. O desaparecimento ou mesmo a não detecção de espécies degradadoras é comum, dependendo das condições adequadas de ensaio, dos requerimentos nutricionais e das propriedades dos genes responsáveis pela biodegradação das espécies. Pode-se concluir que nas amostras que apresentaram resultado positivo as linhagens envolvidas na biodegradação são distintas, exigindo ou não a presença de fonte de N. A seleção imposta por cetrimida permitiu discriminar linhagens distintas também. O estudo de biodegradação de atrazina vem sendo realizado por 3 décadas e a seleção de linhagem pura mineralizadora tornou-se um grande desafio aos pesquisadores. Somente em 1995, após décadas de insucesso, vários laboratórios publicaram tal façanha (Mandelbaum et al, 1995; Radosevich et al, 1995; Struthers et al, 1998) e o arsenal genético destas linhagens vem sendo desvendado (de Souza et al, 1995; 1996; 1998; Sadowsky et al, 1998). Nossos resultados obtidos com os microrganismos selecionados por atrazina e 2,4-D em sua habilidade de metabolizar atrazina são altamente promissores. Estudos sobre o destino da molécula de atrazina necessitam ser realizados com composto radiomarcado, mas os cromatogramas da cromatografia líquida não revelaram a presença de metabólitos no meio. Estudos de biorremediação e fitorremediação foram descritos por Strutters et al, 1998 e Rice et al, 1997. Os microrganismos das amostras de solo serão empregados no desenvolvimento de processos de biorremediação. Para aprimorar processos de biorremediação estamos desenvolvendo processos de microencapsulação para microrganismos. Microrganismos microencapsulados poderiam preservar características apropriadas otimizando-se o processo de biorremediação, na tentativa de se reverter insucessos quando se inocula microrganismos a sítios contaminados. O processo de microencapsulação pode empregar polímeros biodegradáveis de material sintético ou natural, modificado ou não. O sucesso desta tecnologia vem sendo alcançado para um imenso número de substâncias seja para a área farmacêutica, agrária (pesticidas, Greene et al, 1992; Ferraz et al, 1997) e outras. O pioneiro na aplicação desta tecnologia foi o do papel com cópia sem folha de carbono da Appleton Papers em 1954, mas pode ser rotineiramente observado em produtos de supermercado como sabão em pó, detergentes, pastas de dentes, dermocosméticos. A microencapsulação de células vivas é mais recente, tendo sido descrita para ilhotas de Langerhans, células pancreáticas capazes de produzir insulina, para serem empregadas em pacientes diabéticos insulino-dependentes. Para o nosso trabalho estamos empregando polímero biodegradável à base de caseína. As microcápsulas de caseína são produzidas no laboratório de Tecnologia Farmacêutica para o processo de biorremediação de sítios contaminados. As características das microcápsulas pode variar de acordo com o ambiente seja solo ou água em área delimitada ou não. O estudo dos microrganismos e da biodegradação dos herbicidas aliado à tecnologia de microencapsulação para descontaminação representa ferramenta que garante um futuro promissor como alternativa tecnológica mitigadora da ação poluidora do homem. Não substitui, no entanto, o uso racional dos agroquímicos que permite manter ambientes essenciais à vida do homem sem risco de contaminação.

Referências bibliográficas

Behki, RM and Khan, SU (1986) - Degradation of atrazine by Pseudomonas: N-dealkylation and dehalogenation of atrazine and its metabolites. J Agric Food Chem. 34:746-749.

Behki, RM; Topp, E; Dick, W; Germon P (1993) - Degradation of atrazine, propazine, and simazine by Rhodococcus strain B-30. J Agric Food Chem 42:1237-1241.

Belluck, DA; Benjamin, SL; Dawson, T (1991) - Groundwater contamination by atrazine and its metabolites. In: Pesticide Transformation Products, ACS Symposium Series, American Chemical Society, pp 254-273.

Bode, LE (1990) – Agricultural chemical application practices to reduce environmental contamination. Am J Ind Med 485-489.

Bowmer, KH (1991) – Atrazine persistence and toxicity in 2 irrigated soils of Ausralia. Aust J Soil Sci 29:339-350.

Cerdeira, AL; Lanchote, VL;Gomes, MA; Bonato, P; Pessoa, M; Shuhama, IK; Ueta, J (1998) – Herbicide residue in soil and water from sugarcane area in Brazil. In Congrès Mondial de Science du Sol, 16 Anais 1-7.

de Cal, A; Pascual, S; Obrador, A; Tadeo, JL; Melgarejo, P (1993) - Efecto de los herbicidas atracina y alacloro sobre la microflora del suelo de un monocultivo de maiz. Invest. Agr.: Prod. Prot. Veg. 8:97-108.

de Souza, ML; Seffernick, J; Martinez, B; Sadowsky, MJ; Wackett, LP (1998) – The atrazine catabolism genes atzABC are widespread and highly conserved. J Bacteriol 181:1951-1954.

de Souza, ML; Sadowsky, MJ; Wackett, LP (1996) – Atrazine chlorohydrolase from Pseudomonas sp strain ADP: gene sequence, enzyme purification, and protein characterization. J Bacteriol. 178:4894-4900.

de Souza, ML; Wackett, LP; Boundy-Mills, KL; Mandelbaum, RT; Sadowsky, MJ (1995) Cloning, characterization, and expression of a gene region from Pseudomonas sp strain ADP involved in the dechlorination of atrazine. Appl Environ Microbiol 61:3373-3378.

Ferraz, A; Souza, JA; Silva, FT; Gonçalves, AR; Bruns, RE; Cotrin, AR; Wilkins, RM (1997) – Controlled-release of 2,4-D from granular matrix formulations based on six lignins. J Agric Food Chem 45:1001-1005.

Foster, S.; Ventura, M.; Hirata, R. Poluição das águas subterrâneas: um documento executivo da situação da América Latina e Caribe com relação ao abastecimento de água potável. Trad. Ricardo Hirata. São Paulo, Instituto Geológico, 1993. 55 p.

Flury, M. Experimental evidence of transport of pesticides through field soils - a review. J. Environ. Qual. 25: 25-45. 1996.

Gaur AC; Misra KC (1978) - Dynamics of microbial population in soil as influenced by simazine and ecological factors. Zentralbl Bakteriol (Naturwiss)133:357-361.

Greene, LC; Meyers, PA; Springer, JT; Banks, PA (1992) – Biological evaluation of pesticides released from temperature-responsive microcapsules. J. Agric Food Chem 40:2274-2278.

Hallberg, GR (1989) – Agr Ecosys Environ 26:299-367

Hicks, RJ; Stotzky, G; Van Voris, P (1990) Review and evaluation of the effects of xenobiotic chemicals on microorganisms in soil. Adv. Appl. Microbiol. 35:195-253.

Hankin, L.; Pylpiw, HMJ. Pesticide in orange juice sold in Connecticut. J Food Protection. 54(4): 310-311. 1991.

Kobayashi, H and Rittmann, B E (1982)- Microbial removal of hazardous organic compounds. Environ. Sci. Technol. 16: 171 A - 183 A .

Lara, WH.; Barreto, HH. Resíduos de pesticidas clorados em águas. Revista IAL. 32: 69-74. 1972.

Levanon, D (1993) – Roles of fungi and bacteria in the mineralization of the pesticides atrazine, alachlor, malathion and carbofuran in soil. Soil Biol Biochem 25:1097-1105.

Mandelbaum, RT; Allan, RD; Wackett, LP (1995) – Isolation and characterization of a Pseudomonas sp that mineralizes the s-triazine herbicide atrazine. Appl Environ Microbiol. 61:1451-1457.

Parsons, B; Witt, JM (1989) – Pesicides in groundwater in the USA. A report of a 1988 survey of US states. EM 8406; Oregon State University Extension Service.

Peixoto, MSP; Lavorenti, A; Regitano, JB; Tornisielo, VL (2000) – Degradação e formação de resíduos ligados de 14C- atrazina em latossolo vermelho escuro e glei húmico. Sci Agric 57.

Percich, JA; Lockwood, JL (1978) Interaction of atrazine with soil microorganisms: population changes and accumulation. Can. J. Microbiol. 24:1145-1152.

Pereira, WE.; Hostettler, F.D. Nonpoint source contamination of the Mississipi river and its tributaries by herbicides. Environ. Sci. Technol. 27: 1542-1552. 1993.

Radosevich, MS; Traina, SJ; Hao, Y-L; Tuovinem, O (1995) Degradation and mineralization of atrazine by soil bacteria isolate. Appl. Environ. Microbiol. 61:297-302.

Rocha, GA. Mega reservatório de água subterrânea do Cone Sul: bases para uma política de desenvolvimento e gestão. UFPR/IDRC, Curitiba, 1996. 25 p.

Rocha, A; Costa, FM; Shuhama, IK; Cerdeira, AL.; Ueta, J(1997) - Caracterização sazonal do efeito de atrazina e 2,4-D sobre microrganismos de solos da microbacia do Córrego do Espraiado, Ribeirão Preto-SP. In: Anais do XXI Congresso Brasileiro de Ciência das Plantas Daninhas. SBCPD, Caxambu,. p. 362.

Sadowsky, MJ; Tong, Z; de Souza, ML; Wackett, LP (1998) – AtzC is a new member of the aminohydrolase protein superfamily and is homologous to other atrazine-metabolizing enzymes. J Bacteriol 180:152-158.

Solomon, KR (1996) –Ecological risk assessment of atrazine in North American surface waters. Environ Toxicol Chem 15:31-76.

Spadotto, CA.; Gomes, MAF; Neves, MC; Luiz, AJB (1996) - Caracterização do uso de agrotóxicos no Brasil: subsídio para o gerenciamento dos riscos ambientais. In:Anais do XII Congresso Latino-Americano de Ciência do Solo. SBCS/ESALQ, Águas de Lindóia,. 04 p (Editado em CD-ROM).

Strutters,JK; Jayachandran, K; Moorman (1998) – Biodegradation of atrazine by Agrobacterium radiobacter J14a and use of this strain in bioremediation of contaminated soil. Appl. Environm. Microbiol 64:33688-3375.

Ueta, J.; Pereira, NL; Shuhama, IK; Cerdeira, AL (1999) – Biodegradação de herbicidas e biorremediação. Microrganismos degradadores do herbicida atrazida Biotecnologia 10:10-13

Wauchope, RD.(1978) - The pesticide content of surface water draining from agricultural fields - a review. J. Environ. Qual. 7: 459-472.

Williams, WM; Holdem, PW; Parsons, DW; Lorber, MN ( 1988) - Pesticides in groundwater data base 1988 Interim Report. Office Pesticide Programs, U.S.Environmental Protection Agency, Washington, p. 37.

Yanze-Kontchou, C and Gschwind, N (1994) - Mineralization of the herbicide atrazine as a carbon source by a Pseudomonas strain. Appl. Environ. Microbiol. 60:4297-4302.

Yen, PY; Koshiken, WC; Schweizer, EE. (1994) - Dissipation of alachlor in four soils as influenced by degradation and sorption processes. Weed Sci. 42: 233-240.

Zhang, M; Geng, S; Ustin, SL; Tanji, KK.(1997) - Pesticide occurence in groundwater in Tulare county, California. Environ. Monit. Ass. 45: 101-127.

Zwieten, LV and Kennedy, IR (1995) – Rapid degradation of atrazine by Rhodococcus sp NI86/21 and by an atrazine-perfused soil. J Agric Food Chem 43:1377-1382.

Participaram deste trabalho pós-graduandos, estagiários graduandos e técnicos especializados orientados pelos autores do trabalho da FCFRP-USP