Estratégia biotecnológica para produção de silagem de milho mais nutritiva
Magali F. Grando 1 e Robert G. Shatters Jr.21 Inst. Ciências Biológicas e Fac. de Agronomia e Medicina VeterináriaUniversidade de Passo Fundo, Cx. Postal 611,99001-970, Passo Fundo-RS. E-mail: magali@upf.tche.br2 Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), Fort Pierce-FL, EUA;Departamento de Agronomia, Universidade da Florida, Gainesville-FL, EUA.E-mail: rshatters@ushrl.ars.usda.gov Silagem de Milho
O milho (Zea mays L.) é um dos principais produtos agrícolas utilizado para o consumo humano e animal. O Brasil é o terceiro maior produtor mundial de milho com uma produção de 36,7 milhões de toneladas em 2000/2001, perdendo apenas para os Estados Unidos e a China. O milho na alimentação animal é utilizado em forma de ração e de silagem, a qual é uma forragem úmida conservada pelo baixo pH resultante da fermentação dos açúcares da planta por bactérias anaeróbicas. A alta concentração de carboidratos hidrossolúveis faz com que o milho seja a espécie vegetal mais apropriada para produção de silagem, sendo esta uma excelente fonte de energia na alimentação do gado de leite e de corte. No entanto, a baixa concentração de proteína bruta na silagem de milho é reconhecida como um fator limitante a sua utilização (Dudley, 1977; Denayer et al., 1980). Em média a silagem de milho apresenta 8,5% de proteína bruta, sendo que o recomendável para gado de leite e gado de corte em fase de crescimento é de 12 a 16% (Ball et al., 1991). Por esta razão a adição de outras fontes de proteína à silagem de milho é essencial para o bom desempenho dos animais. O desenvolvimento de variedades com mais alta concentração de proteína na silagem reduziria a utilização de suplemento protéico, conseqüentemente diminuindo os custos da produção de carne e leite.
Estratégias para alteração do valor nutricional em gramíneas forrageiras
Duas estratégias podem ser utilizadas para incrementar o valor nutricional de forrageiras: melhoramento convencional de plantas e a biotecnologia. Sucesso tem sido alcançado no melhoramento da qualidade de forragem no que diz respeito ao aumento da digestibilidade, resistência à doenças e modificações na concentração de alcalóides e minerais, como relatado por Vogel e Sleper (1994). No entanto, a variabilidade genética para concentração de proteína é muito estreita nas gramíneas forrageiras. O fato de que os maiores componentes protéicos nas gramíneas estão envolvidos em atividades metabólicas da planta, isto é, não são proteínas de reserva, indica que alteração significativa no conteúdo e qualidade de proteínas é pouco viável utilizando-se o melhoramento convencional (Vogel e Sleper, 1994).Até recentemente, apenas os genes da própria espécie ou espécies parentais eram disponíveis para os programas de melhoramento realizado através de cruzamentos. O desenvolvimento da engenharia genética tornou possível a transferência de características herdáveis entre espécies não relacionadas, pela introdução de genes diretamente no núcleo das células receptoras. Esta técnica amplia as fontes genéticas e a variabilidade disponível para o melhoramento de plantas. Uma vez o gene, que é um segmento de DNA que codifica uma proteína, se integra no genoma da planta receptora, este poderá produzir uma nova proteína que confere uma nova característica para a planta. As primeiras plantas transgênicas, ou seja, plantas portadoras de um gene introduzido de forma assexual, receberam genes que conferem tolerância a herbicidas, resistência a doenças e insetos, o que resultou em produtos com menor custo de produção e com menor impacto ambiental devido à redução do uso de defensivos agrícolas. Um dos objetivos da engenharia genética tem sido produzir plantas modificadas que apresentem melhor nutrição para seres humanos e animais, o que vem a beneficiar não somente o produtor, mas também o consumidor. Um exemplo desta nova fase da biotecnologia foi a produção do arroz dourado contendo alta concentração de pró-vitamina A por uma equipe de cientistas da Suíça e Alemanha. A introdução de genes através da engenharia genética pode permitir o melhoramento da quantidade e qualidade de proteína através da expressão de proteínas de reserva não encontradas normalmente na planta alvo. Genes codificadores de proteínas de reserva de sementes de várias espécies de plantas têm sido transferidos para plantas receptoras, resultando numa melhoria do valor nutricional das mesmas (Molvig et al., 1997; Khan et al., 1996; Tabe e Higgins,1998). No entanto, as proteínas de reserva de semente têm se mostrado instáveis quando expressas em tecidos vegetativos, como folhas e caules de plantas transgênicas, sendo estáveis apenas nas sementes. Uso de um gene da soja para alterar a concentração de proteína na silagem de milho
A nossa proposta foi incrementar a concentração de proteína no milho pela introdução de genes de proteínas de reserva que tenham grande capacidade de armazenamento nos tecidos vegetativos da planta. A soja possui proteínas de reserva da parte vegetativa denominadas de VSP (vegetative storage protein). As duas subunidades da proteína, VSP-a e VSP-b, que são codificadas pelos genes vspA e vspB, respectivamente, são proteínas ricas em lisina (amino ácido essencial), que se acumulam nos órgãos vegetativos. Nas folhas jovens da soja, antes do florescimento, estas proteínas perfazem um total de 15% das proteínas solúveis da folha, e são consideradas reserva temporária de nitrogênio para a planta. Durante a formação da semente estas proteínas são degradadas para suprir a semente com o nitrogênio necessário ao seu desenvolvimento (Wittenbach, 1983; Staswick, 1988; Staswick, 1994). Assim, vários experimentos foram realizados na Universidade da Florida com o objetivo de melhorar a concentração de proteína na silagem pela introdução do gene vspB da soja no milho, o qual codifica a proteína de reserva VSP-b.
Introdução do gene vspB da soja no milho pela engenharia genética
Para obtenção de uma planta transgênica, o gene deve ser introduzido ao nível de células e tecidos, os quais permitem a regeneração de uma planta completa e fértil. Desta forma, as técnicas de cultura de tecidos in vitro servem como base para o desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas. O bombardeamento de genes é um dos métodos mais utilizados para a transferência de genes em plantas monocotiledôneas.Calos embriogênicos de milho com alto potencial de regeneração foram bombardeados com partículas de ouro cobertas por plasmídeos (DNA circular) contendo o gene vspB da soja e o gene bar que confere resistência ao herbicida glufosinato (agente ativo fosfinotricina). Este último gene serve como marcador facilitando a seleção e regeneração de plantas transgênicas pela adição do herbicida no meio de cultura onde os tecidos do milho são manipulados. O gene vspB deve se integrar ao patrimônio genético da planta em um local onde este possa se expressar produzindo a proteína VSP-b. Na figura 1 é mostrado o esquema de introdução de genes no milho pelo método de bombardeamento.Após o bombardeamento, os calos foram cultivados em meio de cultura nutritivo contendo o herbicida, o qual permite o crescimento somente das células que receberam os genes (Fig. 2). Plantas completas foram regeneradas a partir dos calos resistentes ao herbicida (Fig. 3). Posteriormente, as plantas foram transferidas do meio de cultura para solo e transferidas para casa de vegetação.As plantas regeneradas foram avaliadas quanto à presença e expressão do gene da soja. O gene vspB foi detectado no milho pela análise molecular do DNA, utilizando-se a técnica denominada “Southern blot”. A análise genética da segunda geração confirmou que o gene da soja foi transmitido para a progênie das plantas transgênicas de milho. A figura 4 mostra a segunda geração de plantas trangênicas de milho sendo desenvolvidas em casa de vegetação. O milho transgênico apresentou características fenotípicas normais, não diferindo das plantas controles não transgênicas.A expressão do gene, ou seja, a existência da proteína VSP-b da soja no milho foi detectada pela técnica de “Western blot”, a qual utiliza anticorpos específicos que reconhecem a proteína da soja. Uma das plantas regeneradas de calos bombardeados chegou a conter a proteína da soja numa concentração de 0,6% das proteínas solúveis em folhas jovens de milho, o que é um valor considerado alto para uma planta modificada geneticamente. No entanto, para promover uma alteração no valor nutricional da silagem de milho é necessário que se alcance mais altos níveis de expressão do gene vspB.
Considerações finais
Pela primeira vez foi demonstrado a expressão de uma proteína de reserva vegetativa proveniente de uma planta leguminosa (a soja) em uma gramínea (o milho). Isto expressa a potencialidade da engenharia genética no melhoramento do valor nutricional de plantas gramíneas tropicais, as quais são geralmente pobres em conteúdo protéico e apresentam baixos teores do amino ácido lisina. Se faz necessário, porém, a criação de novas linhagens transgênicas independentes para se ter a chance de selecionar plantas de milho com mais alta concentração desta proteína da soja. Embora esta pesquisa tenha sido desenvolvida inicialmente na Universidade da Florida, Estados Unidos, temos interesse em estabelecer as técnicas de transformação de plantas e aplicar esta estratégia no Brasil. Com o incremento da concentração de proteínas na silagem de milho poder-se-á reduzir a suplementação protéica adicionada à mesma e assim reduzir os custos de produção da alimentação animal. Isto possibilitaria que pessoas de menor poder aquisitivo tivessem maior acesso a produtos nobres como carne, leite e derivados.
Bibliografia citadaBall DM, Hoveland CS e Lacefield GD. 1991. Southern Forages. Potash and Phosphate Inst., Norcross, GA.Denayer J, Nicks B, Bienfait JM , Lambot O, Van Eenaeme C e Cordiez E. 1980. Energy and protein levels in maize silage rations for growing-fattening young bulls. in Pollmer WR and RH (Eds.), Improvement of Quality Traits of Maize for Grain and Silage Use, Martinus Nijhoff Publishers b.v., The Hague/Boston/London. pp.365-383.Dudley JW. 1977. Seventy-six generation of selection for oil and protein percentage in maize. P.459-473. In Pollak WR et al.(Ed.), Proc. Int. conf. Quant. Genet., Iowa state Univ., Ames. Iowa Univ. Press, Ames. pp. 16-21.Khan MRI, Ceriotti A, Tabe L, Aryan A, McNabb W, Moore A, Craig S, Spencer D e Higgins TJV. 1996. Accumulation of a sulfur-rich seed albumin from sunflower in the leaves of transgenic subterranean clover (Trifolium subterraneum L.) Transgenic Res. 5:179-185.Molvig L, Tabe LM, Eggum BO, Moore AE, Craig S, Spencer D e Higgins TJ. 1997. Enhanced methionine levels and increased nutritional value of seeds of transgenic lupins (Lupinus angustifolius L.) expressing a sunflower seed albumin gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:833-8398.Staswick PE. 1988. Soybeans vegetative storage protein structure and gene expression. Plant Physiol. 87:250-254.Staswick PE. 1994. Storage proteins of vegetative plant tissues. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 45:303-322.Tabe L e Higgins TJV. 1998. Engineering plant protein composition for improved nutrition. Trends Plant Sci. 3:282-286.Vogel KP e Sleper DA. 1994. Alteration of plant via genetics and plant breeding. In Faher GC (Ed.) Forage Quality, Evaluation, and Utilization. American Society of Agronomy, Inc. Madison, Wisconsin, USA. pp.891-921.Wittenbach VA. 1983. Purification and characterization of a soybean leaf storage glycoprotein. Plant Physiol. 73:125-129.